编号 |
成分 |
规格 |
试剂一 |
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer |
200 μL(橘黄盖) |
试剂二 |
MMLV-Taq Mix |
75 μL(红盖 |
试剂三 |
超纯水 |
1 mL(亮黄盖) |
试剂四 |
Everglades病毒 RT-PCR 引物混合液 |
100 μL(白盖) |
试剂五 |
Everglades病毒 RT-PCR 阳性对照(1×10E8 /μL) |
50 μL(黄盖) |
试剂六 |
使用手册 |
1 份 |
运输及保存:
低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置,因为其容易污染其他成分,造成假阳性。
自备试剂:
样品 RNA。
Everglades病毒RT-PCR试剂盒
使用方法:
一、样品 RNA 的制备:
1. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL Everglades病毒PCR阳性对照的 1000 倍稀释液作为制备的阳性对照。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
二、设置 RT-PCR 反应(20μL 体系):
3. 如果有 N+2 个样品,则标记 N+4 个 PCR 管(额外增加的两个管一个是RT-PCR 阳性对照,另一个是 RT-PCR 阴性对照)并按照下表在 PCR 管中加入下列成分:
成份 |
N+2 个 样品管 |
RT-PCR 阴性对照 |
RT-PCR 阳性对照 |
5×双酶一管式RT-PCR Buffer |
各 4 μL |
4 μL |
4 μL |
Everglades病毒 RT-PCR 引物混合液 |
各 2 μL |
2μL |
2μL |
N+2 个制备的 RNA 样品 |
各 12.5μL |
-- |
-- |
超纯水 |
-- |
12.5μL |
-- |
Everglades病毒 RT-PCR 阳性对照的 1000倍稀释液 |
-- |
-- |
12.5μL |
MMLV-Taq Mix |
1.5 μL |
1.5 μL |
1.5 μL |
过程 |
温度 |
时间 |
逆转录 |
42℃ |
30 min |
预变性 |
95℃ |
5 min |
PCR 反应(35 个循环) |
95℃ |
30 sec |
58℃ |
30 sec |
|
72℃ |
20 sec |
|
后延伸 |
72℃ |
7 min |