甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒
测定方法: 分光光度法
测定规格: 10管/9样
保存条件: 低温避光保存
有 效 期: 6个月
注 意: 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
MCS广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,与柠檬酸合酶(CS)共同参与三羧酸循环的调节。
测定原理:
MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A,进一步水解产生甲基柠檬酸;该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB,在 412nm处有特征吸光值。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体10mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:液体2mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体0.2mL×1支,-20℃保存;
试剂四:液体10mL×1瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1支,4℃保存,临用前加入320μL无水乙醇;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂六:粉剂×1支,-20℃保存,临用前加入320μL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂七:粉剂×1支,-20℃保存,临用前加入320μL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
组织、或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
①称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆600g,4℃离心5min。
③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的CS(此步可选做)。
⑤在步骤④中的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体CS测定。