转氢酶-1 测试盒
测定方法: 微量法
测定规格: 100管/96样
保存条件: 低温避光保存
有 效 期: 6个月
注 意 : 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
TH位于线粒体的内膜上,又称为呼吸电子传递链复合体六,催化NADH+NADP+和 NAD++NADPH相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体NADH含量增加时会导致线粒体膜的H+电化学梯度升高,因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进NADH转换为NADPH,从而提高线粒体的抗氧化能力。
测定原理:
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP+)替代NADP+,TH-1催化 APADP+还原生成的APADPH在375nm有特征光吸收,因此通过测定375nm光吸收增加速率,来计算TH-1活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理:
组织、或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
①准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆600g,4℃离心5min。
③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心10min。
④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-1(此步可选做)。
⑤步骤④中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-1活性测定。
